合作文章│Science Advances: 巨噬細(xì)胞中的Gasdermin D通過(guò)控制cGAS介導(dǎo)的炎癥來(lái)抑制結(jié)腸炎
英文標(biāo)題：Gasdermin D in macrophages restrains colitisby controlling cGAS-mediated inflammation
中文標(biāo)題：巨噬細(xì)胞中的Gasdermin D通過(guò)控制cGAS介導(dǎo)的炎癥來(lái)抑制結(jié)腸炎
發(fā)表期刊：Science子刊Science Advances
影響因子：12.804
技術(shù)手段：小鼠結(jié)腸組織LC-MS/MS cGAMP靶標(biāo)定量
敏心生物協(xié)助南京醫(yī)科大學(xué)發(fā)表文章于Science子刊Science Advances
研究背景
炎癥性腸病（IBDs）是一種慢性的、復(fù)雜的疾病，其特征是腸道致病性炎癥失控和腸組織損傷。炎癥小體在黏膜免疫和結(jié)腸炎中的作用的潛在機(jī)制尚不清楚。一般認(rèn)為炎癥相關(guān)蛋白以微生物群依賴的方式在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中發(fā)揮保護(hù)作用，但也有研究表明，有的炎癥小體在基線結(jié)腸內(nèi)粘液層中可能不需要形成或具備功能。最近發(fā)現(xiàn)Gasdermin D（GSDMD）能夠在炎癥激活下游中發(fā)揮作用，造成細(xì)胞凋亡。GSDMD與感染性休克和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）等疾病的潛在發(fā)病機(jī)制有關(guān)，但是GSDMD對(duì)結(jié)腸炎的作用的功能相關(guān)性和機(jī)制基礎(chǔ)尚不清楚。
研究方法
1、對(duì)小鼠進(jìn)行急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎誘導(dǎo)。收集結(jié)腸進(jìn)行免疫細(xì)胞和組織學(xué)等分析。
2、用ELISA法測(cè)定促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，然后用RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。
3、用ELISA試劑盒采集結(jié)腸勻漿上清液，測(cè)定cGAMP含量。
4、UPLC/MS分析：采用甲醇法提取樣品，然后進(jìn)行LC/MS分析。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Ami（100×2.1 m m，1.7μm）。
5、對(duì)結(jié)腸組織切片進(jìn)行組織學(xué)分析和免疫熒光染色分析，以及對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)行分離及FACS分析與分選。
6、將純化的巨噬細(xì)胞采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞因子基因的表達(dá)。
7、進(jìn)行16SrRNA基因測(cè)序RNA序列分析。
研究結(jié)果
GSDMD蛋白在小鼠的各種組織中高表達(dá)，特別是在腸系膜淋巴結(jié)（MLN）和腸道中（圖1A）。免疫熒光分析顯示GSDMD廣泛分布于LP-Cx3cr1+髓樣細(xì)胞和上皮E-cadherin+細(xì)胞（圖1B）。免疫印跡分析顯示結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中GSDMD和caspase-11的表達(dá)和裂解顯著增加（圖1C）。由結(jié)腸炎誘導(dǎo)的髓系細(xì)胞GSDMD活化主要表現(xiàn)為30kda的裂解片段，而p30和p47片段是IECs的主要裂解帶（圖1D）。這些結(jié)果表明GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在結(jié)腸炎模型中的作用。
（ 圖1）
（A）免疫印跡法分析GSDMD-/-和野生型（WT）小鼠心臟、肝臟、腎臟、肺、mLNs、脾臟、小腸（SI）、結(jié)腸、皮質(zhì)、中腦和小腦中GSDMD的表達(dá)；
（B）免疫熒光標(biāo)記野生型小鼠結(jié)腸切片中GSDMD（紅色）、4′、6-二氨基-2-苯基吲哚（藍(lán)色）和Cx3cr1報(bào)告小鼠結(jié)腸切片中GSDMD（綠色）、Cx3cr1（紅色）和DAPI（藍(lán)色）；
（C）對(duì)照組或DSS處理的WT小鼠在第9天結(jié)腸中GSDMD和caspase-11的免疫印跡分析；
（D） DSS處理的WT小鼠第9天結(jié)腸IECs和骨髓細(xì)胞中GSDMD全長(zhǎng)和裂解的免疫印跡分析。
GSDMD在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中起保護(hù)作用，GSDMD的缺乏會(huì)加重DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，保護(hù)結(jié)腸巨噬細(xì)胞在結(jié)腸炎期間免于死亡。炎癥小體可以通過(guò)調(diào)節(jié)AMPs的產(chǎn)生來(lái)改變微生物的組成，從而避免結(jié)腸炎細(xì)菌的生長(zhǎng)，GSDMD對(duì)AMPs和粘液的產(chǎn)生沒(méi)有影響，但對(duì)控制結(jié)腸炎癥是必不可少的。骨髓細(xì)胞中的GSDMD對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的保護(hù)作用至關(guān)重要，巨噬細(xì)胞中GSDMD的功能對(duì)結(jié)腸炎的表型具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。GSDMD缺乏增強(qiáng)結(jié)腸炎時(shí)結(jié)腸巨噬細(xì)胞cGAS依賴性炎癥。
采用RNA測(cè)序分析DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)病階段（圖2A）。KEGG分析表明，GSDMD-CD11b+F4/80+細(xì)胞上調(diào)的最主要途徑之一是細(xì)胞溶質(zhì)DNA感應(yīng)途徑，其中細(xì)胞溶質(zhì)DNA被cGAS感應(yīng)并觸發(fā)炎癥反應(yīng)（圖2B）。基因集富集分析（GSEA）和基因網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了GSDMD在調(diào)控DNA傳感途徑中的關(guān)鍵作用（圖2C和D）。與此一致，熱圖和RT-PCR分析顯示，許多與cGAS依賴性炎癥相關(guān)的基因在GSDMD-細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加（圖2E和F）。然后在結(jié)腸炎期間測(cè)量了WT和GSDMD-/-結(jié)腸組織中的cGAMP濃度，并檢測(cè)到GSDMD-/-結(jié)腸組織中的cGAMP水平高于WTs（圖2G）。在DSS激發(fā)后，GSDMD-結(jié)腸組織中STING、TBK1和IRF3的磷酸化顯著增加。
（圖2）
（A）結(jié)腸巨噬細(xì)胞分類；
（B） KEGG分析WT和GSDMD-小鼠分離的結(jié)腸巨噬細(xì)胞中最顯著富集的信號(hào)通路；
（C）小鼠結(jié)腸巨噬細(xì)胞“胞漿DNA感應(yīng)途徑”相關(guān)基因的GSEA；
（D）小鼠結(jié)腸巨噬細(xì)胞胞漿DNA傳感途徑相關(guān)基因的基因網(wǎng)絡(luò)分析；
（E）基因熱圖；
（F） RT-qPCR分析小鼠結(jié)腸巨噬細(xì)胞中的指示基因；
（G）WT和GSDMD小鼠結(jié)腸組織中cGAMP水平的UPLC/MS分析；
（H）免疫印跡分析
本研究提出了一個(gè)模型，結(jié)腸巨噬細(xì)胞中的GSDMD控制cGAS介導(dǎo)的炎癥，以應(yīng)對(duì)粘膜屏障損傷后侵襲的腸道細(xì)菌或受損的腸上皮，從而防止結(jié)腸炎的發(fā)展（圖3）。因此，開(kāi)發(fā)專門針對(duì)GSDMD-cGAS信號(hào)的診斷和治療策略可能有助于預(yù)防IBD。
（圖3）
DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎GSDMD功能模型。結(jié)腸巨噬細(xì)胞中的GSDMD控制cGAS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)粘膜屏障損傷后侵襲腸道細(xì)菌或受損腸上皮的DNA，從而防止結(jié)腸炎的發(fā)生。
總結(jié)
在本研究中，觀察到GSDMD蛋白在化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的腸道炎癥過(guò)程中被激活。GSDMD缺乏癥加重實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎不受微生物群變化的影響，也不影響抗菌肽的產(chǎn)生。GSDMD缺乏巨噬細(xì)胞，但不是上皮細(xì)胞，足以驅(qū)動(dòng)這個(gè)惡化的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。并進(jìn)一步證明了GSDMD在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，控制環(huán)GMP-AMP合成酶(cGAS)依賴性炎癥，從而保護(hù)結(jié)腸炎。此外，使用cGAS抑制劑可以挽救gsdmd缺陷小鼠的大腸桿菌表型。總的來(lái)說(shuō)，本文首次證明了GSDMD在控制結(jié)腸炎中的作用，并詳細(xì)描述了其潛在機(jī)制。
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